Introducción

Tanto para el diagnóstico como para el seguimiento de pacientes, es importante que las pruebas del laboratorio clínico expresen resultados numéricos con propiedades como la linealidad, es decir, valores numéricos que reflejen el valor verdadero del mensurando en la muestra del paciente.

Un procedimiento de medida es lineal, a lo largo de un intervalo dado, cuando en ese intervalo, los resultados medidos “en promedio” (es decir, abstrayéndose de la imprecisión) son proporcionales a los valores verdaderos del mensurando. Esto puede expresarse con la ecuación 1:

Valor medido= k * Valor verdadero (k>0) De esta forma, si un procedimiento de medida es lineal y el valor verdadero de la muestra se duplica, el resultado medido se duplica.

Dada la importancia de la característica de desempeño linealidad en los procedimientos de medida cuantitativos, es crucial su verificación.

La guía EP06 versión A2 de la CLSI, proporciona lineamientos para la evaluación de la linealidad de procedimientos de medida cuantitativos, dedicando un capítulo completo al protocolo de verificación de la linealidad que describiremos a continuación.

Muestras del panel de linealidad

Se necesita un mínimo de cinco muestras con valores de concentración asignados o valores de concentración relativa conocida, generalmente expresados como proporción de la muestra alta, PHi

Las concentraciones de las muestras alta y baja deben coincidir o estar próximas a los límites del intervalo lineal declarado por el fabricante.

Las muestras del panel de linealidad pueden ser:

- Muestras comerciales
- Muestras preparadas en el laboratorio a partir de una muestra alta y una muestra blanco (sin mensurando) o baja.
Existen tres esquemas para la preparación de las muestras del panel:

1. Mezcla de volúmenes iguales

En este esquema cada solución intermedia se prepara por mezcla de volúmenes iguales de las muestras adyacentes.

Por ejemplo:

Paso 1 – Mezclando igual volumen de la muestra alta (H, PHi= 1.00) y baja (L, con PHi= 0.00), obtenemos una muestra con PHi= 0.50.

Paso 2 – Mezclando igual volumen de la muestra baja (L, PHi= 0.00) y la muestra preparada en el paso 1 (con PHi= 0.50), obtenemos una muestra con PHi= 0.25.

Paso 3 – Mezclando igual volumen de la muestra alta (H, PHi= 1.00) y la muestra preparada en el paso 1 (con PHi= 0.50), obtenemos una muestra con PHi= 0.75.


Resulta importante mencionar que bajo este esquema de preparación solo es posible crear concentraciones equidistantes en una secuencia H/2n, donde “n” es el número de pasos del proceso de diluciones.

2. Mezcla de volúmenes proporcionales

En este esquema cada muestra intermedia se obtiene a partir de la mezcla proporcional de la muestra blanco o baja y alta; esto permite obtener fácilmente muestras de niveles de concentración arbitrarios. Por ejemplo:

Mezclando 0.9 mL de la muestra alta (H, PHi= 1.00) y 0.1 mL de la muestra baja (L, con PHi= 0.00), obtenemos una muestra con PHi= 0.90.




3. Diluciones seriadas de la muestra alta con muestra blanco

En este esquema cada solución intermedia se prepara por dilución en un factor constante de la muestra anterior.

Por ejemplo:

En un esquema de dilución seriada 1 en 2, los pasos de preparación de las muestras son:

Paso 1 – Mezclando igual volumen de la muestra alta (H) y la muestra blanco, obtenemos la muestra S1.


Paso 2 – Mezclando igual volumen de la muestra S1 y la muestra blanco, obtenemos la muestra S2 y así sucesivamente.


Este método resulta útil en procedimientos de medida con un intervalo de linealidad muy amplio, como por ejemplo carga viral o microbiana por PCR.

En todos los casos, los valores asignados a las muestras (Si) se calculan con la ecuación 2:

Si= PHi * H + (1-PHi) * L

Donde:

H es el valor asignado de la muestra alta.
L es el valor asignado de la muestra baja.

Desarrollo del protocolo de verificación de la linealidad

Una vez preparadas las muestras del panel de linealidad deben ser medidas por duplicado en una corrida analítica. Análisis de datos

El análisis de datos asociado a la verificación de la linealidad consiste en 3 pasos.

Paso 1. Inspección de la integridad de los datos.

Se recomienda realizar la verificación de la integridad de los datos mediante la inspección visual del gráfico de dispersión (figura 1).

Si se detectan problemas obvios de imprecisión, valores atípicos, no linealidad pronunciada u otros patrones cuestionables, la evaluación de datos no debe continuar porque los datos no son lo suficientemente confiables.

Paso 2. Análisis de regresión de mínimos cuadrados ponderados.

En este paso, se debe ajustar una línea recta a los datos mediante el análisis de regresión de mínimos cuadrados ponderados (ecuación 3 y figura 2).


Y= A * E

Donde:

Y es el valor medido (promedio de los replicados)
E es el valor asignado
A es la pendiente de la regresión

En el caso de confeccionar las muestras del panel mezclando una muestra alta con una muestra baja con relación de concentración desconocida, donde solo se dispone de los valores medidos de las muestras alta y baja y no se conocen sus valores esperados ni su relación, el análisis de regresión debe considerar la intercepción.

Paso 3. Cálculo y evaluación de las desviaciones de la linealidad.

Para cada concentración se calcula la desviación de la linealidad en concentración y su intervalo de confianza 90% (IC 90%) (ecuación 4).

Desviación en concentración= Valor medido – Valor predicho

Donde:

Valor medido es el promedio obtenido para cada muestra.

Valor predicho (Y) es el valor obtenido a partir de Y= A * E.

De esta forma tendremos una desviación de la linealidad con su respectivo IC90% para cada muestra del panel:


A continuación, se debe evaluar cada desviación con respecto a la Desviación de la Linealidad tolerable (ADL). La desviación de la linealidad tolerable debe ser menor o igual al Error Sistemático máximo tolerable (ESa).

Plantearemos 4 escenarios posibles:

Escenario 1

Todas las desviaciones y su correspondiente IC se encuentran dentro de +/-ADL → Entonces la verificación de la linealidad se encuentra aceptada (figura 3).


Escenario 2

Todas las desviaciones se encuentran dentro de +/-ADL pero alguno(s) de los límites del IC se encuentran por fuera de +/- ADL → Entonces la verificación de la linealidad se encuentra aceptada (figura 4).


Escenario 3

Alguna(s) de las desviaciones se encuentran fuera de +/-ADL pero alguno de los límites del IC se encuentran por dentro de +/- ADL → Entonces la verificación de la linealidad se encuentra aceptada (figura 5).


En este caso se recomienda la evaluación del desempeño general del procedimiento de medida de modo tal que asegura que es apto para el uso previsto.

Escenario 4

Al menos una de las desviaciones y su IC se encuentra fuera de +/-ADL → Entonces la verificación de la linealidad se encuentra rechazada (figura 6).


La finalidad de la aplicación de esta y otras verificaciones de métodos, mediante el uso de protocolos aprobados y actualizados, es la de aportar evidencia del correcto funcionamiento y aplicabilidad de los diferentes métodos de ensayo, dando seguridad al laboratorio respecto a la calidad y utilidad clínica de los resultados.